测序之pacbio
天然的DNA复制本身就是一个非常高效且准确的过程。真核生物DNA复制的速度达几十个核苷酸/秒，比Sanger测序快了几万倍。
实时观察DNA聚合酶的主要挑战之一是如何能在DNA合成期间检测到单个核苷酸的掺入。PacBio的SMRT技术应用ZMW（zero-mode waveguide，零模式波导）技术使之成为可能。ZMW是一个直径为几十纳米的小孔，它阻止可见的激光（波长大约为600 nm）完全透过ZMW。激光在进入ZMW后迅速衰减，因此，只有底部30 nm被照亮。在每个ZMW中，单个DNA聚合酶分子利用专利技术锚定在底部玻璃的表面。随后核苷酸涌入ZMW中，并在阵列表面扩散。当聚合酶检测到正确的核苷酸时，便将其掺入新生链中，这个过程需要几毫秒，而单纯的扩散只需要几微秒。这种时间差使掺入的核苷酸产生了很高的信号强度，类似于脉冲信号。因此，ZMW有能力在荧光标记核苷酸的背景下检测单个掺入事件。
测序是在专利的SMRT Cell中开展的，每个Cell中有一个阵列，上面有15万个ZMW。每个ZMW都能够包含一个DNA聚合酶及一条不同的DNA样品链。每次运行能够平行检测大约75,000个单分子测序反应。
另外，传统的核苷酸标记方法是将荧光标记连接到核苷酸的碱基上，也就是掺入DNA链中。这对于实时观察DNA合成也是有问题的，因为大分子的染料会干扰DNA聚合酶的活性，或造成聚合反应提前终止。因此，PacBip开发出一种新型的核苷酸标记方法，即在核苷酸的磷酸链上进行标记。这样，一旦核苷酸掺入到新生DNA链中，标记基团就会自动脱落。
PacBio的使用的测序仪器是PacBio RS，它能够实时开展、监控并分析单分子生化反应。PacBio RS使用一个大孔径物镜和四个单光子照相机来收集荧光所发射的光脉冲，观察整个过程；并使用一套优化的算法，将光学系统所捕获的信息翻译成ACGT碱基。一旦测序开始，实时的数据就传送到初步分析流水线，生成碱基身份和质量值。
（1）超长读长
如果把拼接工作看作是在做拼图游戏。NGS获得的读长都很短，就好象把一幅图打成非常小的碎片，然后做拼图。由于碎片太小，因此许多碎片看起来都差不多，这样要拼出一副完整的图难度很大。PacBio RS目前可以获得1300bp的平均读长，明年初随着试剂升级，平均读长可提升至2500-3000bp，这就相当于同样的一幅图，用大的碎片来做拼图，由于大碎片比小碎片的识别度要高，因此完成拼图的难度就可以大幅降低。同NGS通常100-150bp的读长相比，PacBio RS的平均读长提高了近20倍。
（2）准确性高
由于PacBio的单分子测序反应是在ZMW中进行，而每个SMRT cell含有15W个ZMW，因此当把N个ZMW中的单分子测序数据也做个平均，之后再同reference sequence比较，则PacBio的准确率也会大幅上升。另外，在NGS平台上，文库制备时必须要先进行PCR扩增，PCR过程中的bias或者mismatch等将无法在测序时修正，也就意味着这些错误会变成系统误差，且无法通过增加测序覆盖深度来消除。PacBio平台上，文库制备时无需PCR扩增，因此避免了PCR产生的bias等。由于PacBio上产生的错误是随机错误，且错误率并不随着读长增加而升高。因此其一致性准确度可随着测序覆盖深度的增加而提高。当测序覆盖深度达到30×时，PacBio的一致性准确度可以达到99.999%。
（3）速度快、高通量
目前PacBio上所使用的DNA聚合酶的合成速度大概是1-3个碱基/秒，由于在该平台上，聚合酶合成的过程就是序列解读的过程，这意味着测序速度每分钟可超过100个碱基。从样品制备到获得碱基序列的全部流程可在1天内完成。如果使用C2试剂，每个SMRT cell可以获得90M 的可定位数据（mappable data）。现阶段每天最多可运行12个SMRT cell，因此每天可获得的数据是12×90=1080Mb mappable data。
（1）甲基化分析
Pacific Biosciences公司开发的单分子实时（SMRT）DNA测序是一种第三代的测序技术，它利用单个DNA聚合酶分子来开展DNA合成，并监控核苷酸的不断掺入。核苷酸掺入的实时记录，不仅产生了序列读取，还带来了关于聚合酶动力学的宝贵信息。通过这些信息，研究人员能鉴别DNA碱基的修饰。
一般来说，聚合酶在修饰碱基周围的速率要比未修饰DNA慢。通过比较每个模板位点的掺入时间、脉冲间持续时间（IPD），可定量比较这一差异。利用这一方法，研究人员可直接检测DNA甲基化，包括N6-甲基腺嘌呤、5-mC和5-hmC。聚合酶动力学的测定是SMRT测序的内在组成，不会对DNA一级序列的测定有任何不良影响。
（2）病原微生物鉴定
（3）高GC含量区域测序
（4）稀有突变检测