带你走进Sanger测序的世界
测序原理
测序步骤
Sanger测序的优势
背景简介
1953年4月，Watson和Crick关于DNA双螺旋结构的文章发表于Nature，成为生物学研究的里程碑。此后，生命科学进入了DNA解密的时代。道德经所言“道生一，一生二，二生三，三生万物”，这“三生万物”需要的竟然仅仅是四种碱基的排列组合。生命的秘密藏在DNA序列中，首要任务，便是测出这序列内容。1970年，吴瑞先生建立了位置特异性引物延伸的测序方法，开了DNA测序技术的先河。随后在1975年，Sanger建立了自己的测序方法。1977年Gilbert等人建立了化学降解法，同年，Sanger改进了之前的方法，确立了日后第一代测序的主流方法：Sanger测序法。
Sanger测序加快了对于微生物和单个基因研究的脚步，然而面对真核生物复杂而庞大的基因组，早期测序方法低通量、高成本、强劳动的弊端是开展组学研究的主要障碍。新一代测序技术呼之欲出，2003完成的人类基因组计划更是为大规模组学数据时代的开启敲响了钟声。
测序原理
在Sanger测序期间，DNA聚合酶通过向生长链（延伸产物）中加入核苷酸来复制单链DNA模板。链延长发生在引物的3'端，通过与模板的碱基对互补来选择加入到扩增产物中的脱氧核苷酸。
DNA聚合酶也可以掺入核苷酸碱基的类似物。由Sanger于1977年发明的DNA测序的双脱氧终止法通过引入2'，3'-双脱氧核苷酸作为底物终止DNA链进一步延伸，当双脱氧核苷酸加入到DNA链的3'末端时，DNA链的延长被选择性地终止于A，C，G或T。这是因为一旦引入双脱氧核苷酸，它比单脱氧核苷酸缺少一个3'-羟基，无法结合下一个组分，因此DNA链进一步的延伸被终止。
Example cycle sequencing reactions in a thermal cycler
荧光染料包括四种不同发射波长的染料标记的双脱氧核苷酸或染料标记的引物，因为每种染料在光激发下产生不同的荧光信号，可由扩增产物的荧光染料鉴定出3'末端双脱氧核苷酸为A，T，C或G。
Dye terminator chemistry法：四种双脱氧核苷酸各自用不同的荧光染料标记。
Diagram of dye terminator cycle sequencing
Dye primer chemistry法：四个不同的测序引物各自用不同的荧光染料标记。
Diagram of dye primer cycle sequencing
在BigDye terminators,，BigDye primers和BigDye Direct中，使用的荧光染料具有更窄的发射光谱和较少的荧光光谱重叠，可以产生较低的背景噪音。
Emission spectra of the four BigDye dyes
每个染料在被激光激发时发出不同波长的光，因此可以在一次毛细管电泳中检测和区分四种颜色代表的四种碱基。
Fluorescent sequencing compared with radioactive sequencing
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测序步骤
1、分离纯化模板DNA
应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者PCR产物；
将DNA储存在灭菌水里。
注意：不要使用DEPC处理的水，水中不能有EDTA，否则将抑制测序反应。
2、DNA模板定量分析
通过紫外分光光度计定量DNA模板，DNA模板的浓度应该＞0.1ug/ul；
通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。
注意：准确定量DNA模板是测序反应中十分重要的一步。
3、测序反应
和普通PCR相比，测序PCR，使用的引物为单向，且对模板的浓度及纯度要求相当高。
PCR 产物的测序一般使用PCR的其中一条引物；克隆的测序，引物一般位于多克隆位点两端，不同的载体测序的“通用”引物不同。
4、测序反应后纯化
乙醇沉淀（利用96孔板离心机）等方法去掉反应产物中的dNTP，ddNTP和盐分；
纯化得到DNA测序反应产物。
5、On-line变性、毛细管电泳和检测
荧光标记的DNA链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离；
激光诱导的荧光终止剂被检测器识别，直接阅读DNA的核苷酸序列。
6、数据分析
引物之后的20bp甚至50bp之内的序列是不准确的，这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期。
序列末端容易产生N值，峰图较杂。由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生N值。
每个测序反应会提供两个结果，一个是序列，一个是峰图；序列可以用Word，DNAStar、写字板等软件打开，峰图可以用Chromas软件及其他综合性软件打开。
Sanger测序的优势
（1）精准：流程细致，质控环节多，污染低，结果直观可视，假性结果极低。
（2）可进行个性化位点检测，可以任意选择单项测序，Sanger测序个性化基因检测有价格优势。由于临床测序特点是：“目标明确、结果精准、通量小”，Sanger 测序非常适用于临床。
Sanger测序与其他测序方法流程、准确度对比表：
参考资料
1.Wenlong Shen's Blog：DNA序列：生命之钥
2.sunbio的博客：四种测序方法对比及Sanger测序的优势
3.每日生物评论
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